動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)時，容易發(fā)生細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，引發(fā)氧氣供應(yīng)不足、代謝廢物積累、營養(yǎng)不足等問題，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。葡聚糖硫酸鹽是一種常用的抗結(jié)團(tuán)物質(zhì)，有效緩解細(xì)胞結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。但有研究表明葡聚糖硫酸鹽具有一定毒性，在生物樣品中需要將其去除，以保證藥物安全。
賽分科技客戶Biogen（渤健生物）在《Chromatography B》雜志發(fā)表文章，文中采用賽分科技體積排阻色譜柱Zenix SEC-150建立蛋白樣品中葡聚糖硫酸鹽殘留檢測方法。
背景介紹
葡聚糖硫酸鹽是一種白色至灰白色粉末，易溶于水，并以鈉鹽形式存在，分子量范圍3 kDa至2000 kDa。葡聚糖硫酸鹽可作為抗凝劑、抗病毒藥物以及輔料。在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入平均分子量為8000 Da的葡聚糖硫酸鹽，可抑制蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁的結(jié)合，從而提高細(xì)胞的生長和生產(chǎn)力。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，葡聚糖硫酸鹽具有一定毒性，它的毒性依賴于劑量和分子量以及給藥途徑。研究顯示對一組兔子每日服用20 mg/Kg葡聚糖硫酸鹽兩周會造成全身毒性作用。因此，需要采用合適的分析方法控制或者檢測葡聚糖硫酸鹽在生物樣品的含量，保證藥物的質(zhì)量安全。
文章概述
文中基于賽分科技Zenix SEC-150體積排阻色譜柱建立蛋白中葡聚糖硫酸鹽檢測方法。蛋白與葡聚糖硫酸鹽結(jié)合，直接色譜分離并不適用，需要先進(jìn)行預(yù)處理；另一方面，葡聚糖硫酸鹽的檢測需要高靈敏度的方法，直接定量檢測的方式不適用，此前尚無合適的檢測方式。文章開發(fā)的方法采用三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白質(zhì)，使葡聚糖硫酸鹽游離。體積排阻色譜柱Zenix SEC-150分離后洗脫液通過10 μL生物相容性PEEK靜態(tài)混合器進(jìn)行柱后衍生，二亞甲基藍(lán)與葡聚糖硫酸鹽反應(yīng)形成葡聚糖硫酸鹽-DMB染料復(fù)合物，通過復(fù)合物的全波長掃描，確定最大吸收波長，結(jié)合SEC-HPLC檢測。
圖1. 硫酸葡聚糖-DMB染料復(fù)合物全波長掃描及530 nm色譜圖
全波長掃描顯示葡聚糖硫酸鹽-DMB染料復(fù)合物在530 nm可見光處有最大吸收。確定波長為530 nm，使用賽分科技Zenix SEC-150（3 μm，7.8 × 300 mm）色譜柱進(jìn)行分離，測定葡聚糖硫酸鹽的含量，該方法顯示具有良好的分離效果，專屬性驗證合格。
圖2.專屬性驗證
葡聚糖硫酸鹽檢測方法學(xué)驗證表明該方法線性范圍范圍從1.0 μg/mL 到10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線，決定系數(shù)（r2）≥0.99。對LOD和LOQ測定顯示LOD為0.3 μg/mL，蛋白樣品中的葡聚糖硫酸鹽的LOQ為1.5 μg/mL或0.02 mg/g蛋白?；厥章史秶鸀?1%到105%，中間精密度驗證表明3個制備樣的葡聚糖硫酸鹽濃度的%RSD以及3天內(nèi)總體的%RSD低于5%。
結(jié)論
Conclusion
文章采用賽分科技Zenix SEC-150色譜柱測定蛋白樣品葡聚糖硫酸鹽含量，該方法樣品處理簡單，分析時間短，易于開展，經(jīng)方法驗證可用于高濃度純化的蛋白產(chǎn)品中的殘留葡聚糖硫酸鹽的定量檢測。
[1] Tazi, Loubna, M, et al. Determination of residual dextran sulfate in protein products by SEC-HPLC[J]. Journal of chromatography, B. Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 2016, 1011:89-93.
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