文獻速遞|HIC色譜法高效分離硫酸化雙抗變體
引言
治療性蛋白質(zhì)在生產(chǎn)過程中會經(jīng)歷各種翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），其中蛋白質(zhì)酪氨酸硫酸化（protein tyrosine sulfation，PTS）由細胞內(nèi)酶酪氨酸硫轉(zhuǎn)移酶（tyrosylprotein sulfotransferase，TPST）催化而形成。同時修飾產(chǎn)生的磺酸基會對蛋白分子表面電荷分布造成影響，從而增加產(chǎn)物異質(zhì)性，影響其靶標結(jié)合能力，是治療性蛋白質(zhì)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。
近日，賽分科技客戶百時美施貴寶（Bristol Myers Squibb）發(fā)表相關(guān)文章，介紹了一種基于疏水相互作用色譜（HIC）定量分析PTS的方法。研究人員利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱，根據(jù)硫酸化程度不同，在pH為4的條件下對目標雙特異性抗體進行分離和定量，結(jié)果顯示未硫酸化峰、單硫酸化峰、雙硫酸化峰均實現(xiàn)了基線分離，且回收率在90%以上。研究表明該方法適用于蛋白PTS定量分析。
背景介紹
2017年，科學家證實了CHO細胞產(chǎn)生的抗體輕鏈CDR區(qū)存在硫酸化的酪氨酸，且這種修飾會導致其與同源抗原的結(jié)合減少。因此，對硫酸化修飾產(chǎn)物進行嚴格的質(zhì)量控制十分必要。通常情況下，鑒定和定位肽和蛋白質(zhì)中PTM的基本方法是反相色譜-質(zhì)譜分析。但是酪氨酸硫酸化修飾對酸、熱和高能電離技術(shù)較敏感，在檢測過程中很容易被破壞而無法被檢出。若使用離子交換色譜法或等電聚焦法進行分析，結(jié)合硫酸化酶處理可以檢測到酪氨酸硫酸化的存在，但由于硫酸化修飾和其他帶負電荷的變體（如脫酰胺）發(fā)生峰重疊，會導致定量不準確。因此，為了實現(xiàn)對硫酸化變體分離與定量分析，研究人員選擇賽分科技的Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱。這種色譜柱結(jié)合了表面改性的PS-DVB與丁基配體，可以準確地對硫酸化變體進行分析和定量，確保目標治療性抗體的質(zhì)量穩(wěn)定。
文章概述
本研究利用Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱對重組雙抗中的硫酸化分子進行定量分析。與競品相比，該款色譜柱可以實現(xiàn)更好的分離效果。此外，與離子交換色譜法對比發(fā)現(xiàn)，該方法對酪氨酸硫酸化表現(xiàn)出高特異性。盡管磺酸基團會增加抗體表面親水性，但憑借賽分科技專有的固定相表面修飾技術(shù)，Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱可以減少非特異性相互作用，從而避免常見PTM如強制脫酰胺對定量分析的影響。進一步研究表明，該測定方法可以對硫酸化修飾的治療性蛋白質(zhì)進行高效準確的分析檢測和質(zhì)量控制。
硫酸化變體分析
Column: Vendor Butyl-NPR (2.5 μm, 4.6 × 100 mm)
Proteomix HIC Butyl-NP5 (5 μm, 4.6 × 100 mm)
Mobile Phase:
A: 80 mM sodium phosphate pH 7.0 with 2 M ammonium sulfate
B: 100 mM sodium phosphate pH 7.0, (gradient elution)
Flow Rate: 1 mL/min
Temp: 25 °C
Detection: 220 nm
Sample Amount: 5 μL，10mg/mL
圖1. 不同基質(zhì)的Butyl 疏水色譜柱的磺化雙抗分離圖譜（pH 7.0）
（A.Vendor Butyl-NPR測試圖；B. Proteomix HIC Butyl-NP5測試圖）
圖1是競品PMA基質(zhì)的HIC色譜柱和賽分科技PS-DVB基質(zhì)的Proteomix HIC Butyl-NP5在pH 7.0下的分離圖譜。從圖中可以看出，經(jīng)硫酸化酶處理后，小峰消失，主峰升高。這表示sY1和sY2峰與酪氨酸硫酸化有關(guān)，其中sY1為單硫酸化峰，sY2為雙硫酸化峰，而sY0則為未硫酸化的峰。圖1A和圖1B中兩個小峰與主峰分離，洗脫順序相反。這是因為Proteomix HIC Butyl-NP5色譜柱專有的表面修飾工藝。對比可知，圖1.A中sY0和sY1峰之間的分離度是0.6，而圖1.B中則是1.0，說明Proteomix HIC Butyl-NP5的分辨率優(yōu)于競品。
脫酰胺化分析
脫酰胺是翻譯后修飾產(chǎn)物最常見的降解途徑之一，研究人員通過強制脫酰胺來評估應用Proteomix HIC Butyl-NP5色譜柱HIC的方法是否受到這種蛋白質(zhì)降解的影響。
為了避免雙抗樣品自身羧基對電荷及疏水性的潛在影響，研究人員采用pH值為4的流動相，確保在此條件下HIC方法樣品根據(jù)硫酸化程度差別分離雙抗，并且保證sY0、sY1和sY2三個峰的基線分辨率均高于1.5。
圖2.不同分離模式下脫酰胺前后的雙抗樣品檢測圖譜
（A.離子交換模式.B.疏水模式）
圖2展示了pH為4的條件下，不同分離模式下對于脫酰胺樣品的分離情況。圖1.A顯示，在pH值為4時，脫酰胺使酸性基團從21.1%增加到36.3%。而如圖1.B所示，sY0峰從74.2%略微下降到73.4%，伴隨有一個小的早期洗脫峰從0.2%上升到0.9%。sY1和sY2的水平相對穩(wěn)定，分別在23.0%和2.7%左右，整體無顯著變化。雙抗脫酰胺前后進行離子交換和疏水色譜的分析結(jié)果顯示脫酰胺對HIC法測定的該雙抗硫酸化變體沒有影響，Proteomix HIC Butyl-NP5色譜柱可以避免與質(zhì)子化產(chǎn)物發(fā)生非特異性相互作用。
實驗結(jié)論
綜上所述，研究人員使用賽分科技Proteomix HIC Butyl-NP5疏水色譜柱，提供了一種新的有效分析手段，可以在pH為4的條件下對抗體的硫酸化變體進行定量檢測。此外，該方法對酪氨酸硫酸化具有高特異性，不受其他常見PTMs（如脫酰胺化）的影響。實驗證明該方法是控制硫酸化修飾這一重要質(zhì)量屬性的有效手段。
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