引言
結合疫苗，尤其是針對2歲以下兒童的疫苗，通過將多糖與蛋白載體偶聯(lián)，可以提高免疫原性。然而，實驗過程中發(fā)現(xiàn)，利用白喉減毒毒素(CRM197蛋白)作為載體蛋白而制成的結合疫苗，會存在游離蛋白，影響藥物品質，且通過傳統(tǒng)方式難以精確檢出，具有較高的安全隱患。
艾美衛(wèi)信生物藥業(yè)(浙江)有限公司開發(fā)的高效液相色譜(HPLC)測定方法，采用了SRT SEC-300(7.8×300mm)色譜柱，配合特定的色譜條件，實現(xiàn)了對游離CRM197蛋白含量的精確測定。與競品色譜柱相比，SRT SEC-300色譜柱具有更高的分離度和信噪比，能夠更有效地將CRM197蛋白從結合物中分離出來，顯著提升了檢測的靈敏度和精確度。此外，該方法優(yōu)化了柱溫和pH值，確保了方法的穩(wěn)定性和重復性(專利號CN110018253A，點擊文末閱讀原文查詢文章)。
背景介紹
多糖疫苗抗原(CPS)屬于胸腺非依賴性抗原(TI-Ag)，無法充分激發(fā)兒童的免疫系統(tǒng)。通過將多糖與蛋白載體偶聯(lián)，制成結合疫苗，可以將TI-Ag轉變?yōu)樾叵僖蕾囆钥乖?TD-Ag)，從而增強免疫原性，為兒童提供長期保護。然而，在制備結合疫苗的過程中，游離蛋白可能會影響疫苗的免疫效果，甚至引發(fā)不良反應。因此，精確檢測其含量變得尤為關鍵。
目前，檢測結合疫苗中游離蛋白含量的方法主要是《中國藥典》記載的HPLC法。方法的建立，也受到載體蛋白的性質、檢測分析柱的選型等各方面的影響。本專利采用賽分科技SRT SEC-300色譜柱，實現(xiàn)了對結合疫苗中游離CRM197蛋白含量的精確測定，保證了精確度與重復性，降低了檢測成本，簡化了操作流程，有望成為結合疫苗質量控制中的重要工具，為疫苗的安全性和有效性提供強有力的技術保障。
文章概述
在疫苗研究領域，精準測定游離蛋白含量對于確保疫苗的安全性和有效性至關重要。本專利采用賽分科技SRT SEC-300色譜柱，通過優(yōu)化條件，能夠精確測定出結合疫苗中的游離蛋白含量；同時，實驗可以將CRM197蛋白的檢測限確定在0.15625μg，定量限約為0.625μg，反映了SRT SEC-300(7.8×300mm)色譜柱在低濃度樣品中的高靈敏度和準確性，能夠減少待測樣品的用量，從而降低游離蛋白的檢測成本。該方法在疫苗研發(fā)、藥物篩選評估等方面具有重大意義。
精確度考察
本專利以腦膜炎球菌多糖結合疫苗、b型流感嗜血桿菌多糖結合疫苗、肺炎鏈球菌多糖結合疫苗作為測定樣品，依次命名為結合物a、結合物b、結合物c。將樣品用0.2M氯化鈉稀釋樣品至蛋白濃度為200μg/mL，各取1mL，分別加入0wt%、1wt%、3wt%、5wt%的CRM197蛋白。以加樣回收率來考察精確度，每個樣品檢測3次進行重復性判定。
色譜柱：SRT SEC-300(7.8×300mm,5μm,300Å)
流動相：0.2M NaCl(pH7.2±0.02)
柱溫：23±1℃
流速：0.5mL/min
紫外檢測波長：UV280nm
固定進樣體積：100μL
結果如下：
圖1.結合物a+CRM197蛋白
圖2.結合物b+CRM197蛋白
圖3.結合物c+CRM197蛋白
圖1-圖3是向三種結合物加入不同濃度CRM197蛋白的檢測結果。由圖可知，在設定的試驗參數(shù)和條件下，SRT SEC-300色譜柱分離度較好(＞1.70)，可重復性高。且進一步計算發(fā)現(xiàn)，回收率皆處于80-120%之間，CV%皆小于5%，滿足質量標準要求，表示本檢測方法準確可信。
表1.不同濃度CRM197蛋白的信噪比
表1是向三種結合物加入不同濃度CRM197蛋白所測得的信噪比。根據(jù)檢測結果，可以確定有無CRM197蛋白的檢測限約在0.15625μg，再結合行業(yè)標準中信噪比＞10.0的規(guī)定，可以確定CRM197蛋白含量的定量限在0.625μg左右。
根據(jù)定量限的數(shù)值，大致可以確定進樣樣品中總蛋白含量最小應在12.5μg以上為佳。本專利中，進樣樣品中總蛋白含量在20-50μg，可有效降低樣品的使用量，具有檢測結果精確、檢測成本低的特點。
實驗結論
綜上所述，SRT SEC-300色譜柱，展現(xiàn)出了快速、高效的分離性能，能夠在確保高分離度的同時，維持良好的信噪比，在特定的柱溫和pH條件下，能夠滿足對游離蛋白含量精確測定的高標準要求，這對于保證結合疫苗的安全性和有效性至關重要。
產(chǎn)品介紹
賽分科技SEC系列色譜柱，采用特有的表面修飾技術，分離速度快，分辨率高，通用性好，批次重現(xiàn)性強，適用于質控QC放行，也是分析型SEC值得信賴的產(chǎn)品。
圖2.賽分科技SEC固定相表面修飾工藝
“-C”系列產(chǎn)品，采用賽分科技獨有的固定相修飾工藝（見圖2），硅膠表面鍵合一層“平躺”的單分子層，最大程度減少非特異性相互作用。“-C”系列產(chǎn)品適用于疏水性較強的樣品，可以減少有機相的使用，安全、環(huán)保，讓您的實驗無后顧之憂。
延展閱讀
體積排阻色譜法適用于從小規(guī)模實驗室研究到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的廣泛需求。賽分科技SEC系列產(chǎn)品具有柱容量大、操作簡單、易于自動化的特點，能夠穩(wěn)定、連續(xù)地處理大量樣品，滿足治療性蛋白在疫苗研制、臨床試驗乃至商業(yè)化生產(chǎn)中的高通量需求。
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