蛋白A親和層析的復雜性：從理論純化到現(xiàn)實挑戰(zhàn)的深度解析
目前，蛋白A親和層析儼然是幾乎所有治療性IgG藥物純化的主流技術(shù)，其優(yōu)勢在于工藝簡潔：IgG可特異性結(jié)合蛋白A，而雜質(zhì)流穿，僅需上樣、洗滌和洗脫即可獲得目標產(chǎn)物。然而在實際生產(chǎn)中，洗脫產(chǎn)物仍殘留數(shù)百至數(shù)千ppm的宿主細胞蛋白(HCP)和染色質(zhì)等污染物，表明該技術(shù)存在明顯的特異性局限。因此，蛋白A親和層析并非如傳統(tǒng)描述那般簡單，其復雜性直接影響產(chǎn)品質(zhì)量屬性、純化工藝開發(fā)難度及生產(chǎn)成本控制。深入理解蛋白A親和層析的作用機制，將有助于優(yōu)化其應用效能。
為什么蛋白A的生物特異性無法在親和層析中提供應有的純度?大量研究表明其主要原因包括其他蛋白質(zhì)與層析介質(zhì)之間的非特異性結(jié)合，主要雜質(zhì)與蛋白A配體以及IgG本身之間的非特異性作用，層析過程中IgG在低pH洗脫環(huán)境下形成聚集體等。雜質(zhì)來源于非特異性相互作用等多種因素，下面我們將從幾個重要的觀點角度來解析蛋白A親和層析的復雜性，為純化性能的改進提供理論基礎和實際參考。
1 蛋白A與IgG的相互作用
蛋白A親和層析并非傳統(tǒng)認為的“溫和過程”。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白A與IgG的Fc區(qū)結(jié)合會導致Cγ2結(jié)構(gòu)域及相鄰區(qū)域的構(gòu)象變性，甚至使X射線晶體學無法精確定位α碳原子坐標。洗脫后IgG的流體動力學直徑不足天然分子的一半，該現(xiàn)象在赫賽汀、阿瓦斯汀等多種抗體中均存在，表明具有普適性。
圖1. X射線晶體學顯示的與蛋白A接觸導致IgG變性*
低pH洗脫條件會加劇變性：在pH 2.0-2.5時，F(xiàn)ab區(qū)域會折疊覆蓋Fc區(qū)域。雖可通過調(diào)節(jié)pH和離子強度恢復天然尺寸，但變性后的IgG更易聚集。實驗顯示，將洗脫液(pH 3.5)進一步酸化至pH 3.0后中和，會導致近三分之一抗體聚集，而天然IgG在相同處理下無聚集。這表明蛋白A介導的變性雖不直接引發(fā)聚集，但顯著提高了IgG對外部應激的敏感性。
蛋白A親和層析中，雜質(zhì)-介質(zhì)/配體/IgG間的非特異性相互作用及低pH洗脫誘發(fā)聚集是純度不足的主因。該發(fā)現(xiàn)提示需優(yōu)化層析條件(如預處理、洗脫控制)以提升載量、減少HCP/DNA殘留，為高回收率、低污染工藝開發(fā)提供關(guān)鍵方向。
2 染色質(zhì)與蛋白A的相互作用
染色質(zhì)作為宿主細胞殘留的核心污染物，與蛋白A的結(jié)合力甚至超過IgG。其基本單元核小體(含DNA和組蛋白)通過非共價結(jié)合形成尺寸50-400 nm的異質(zhì)聚集體，攜帶大量非組蛋白宿主蛋白(HCP)、RNA等雜質(zhì)。這些聚集體因尺寸過大無法進入層析介質(zhì)孔道，堆積在介質(zhì)表面，阻塞IgG結(jié)合位點，導致結(jié)合容量下降高達20%。
在低pH洗脫條件下，染色質(zhì)聚集體不穩(wěn)定發(fā)生滲漏，使99%的污染物進入IgG洗脫峰。延長柱停留時間會加劇污染物積累。研究揭示染色質(zhì)形成了“污染物偷渡系統(tǒng)”：其表面組蛋白與蛋白A強結(jié)合，攜帶原本無親和性的雜質(zhì)(如DNA)穿透純化步驟，嚴重挑戰(zhàn)正交工藝設計原則。
解決方案包括：
① 預洗脫去除染色質(zhì)，可降低HCP和DNA達1000倍;
② 優(yōu)化洗脫后pH控制(如調(diào)節(jié)至pH 5.5)促進污染物顆?；筮^濾;
③ 采用強堿清洗介質(zhì)。
這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)需從“污染物復合體”而非單一分子層面重新設計純化工藝。
圖2. 左圖為常規(guī)洗脫步驟收集液色譜圖;右圖為經(jīng)過預洗脫的收集液色譜圖，結(jié)果表明常規(guī)洗脫后仍存在大量積累的染色質(zhì)雜聚集體，預洗脫可有效減少染色質(zhì)雜聚集體含量*
3 IgG與染色質(zhì)的相互作用
在酸性洗脫條件下(pH 3.5)，IgG與染色質(zhì)異質(zhì)聚集體發(fā)生顯著相互作用，導致其溶解度下降至82%并吸附于沉淀的染色質(zhì)。洗脫過程中，IgG可結(jié)合兩類染色質(zhì)組分：滲漏亞群和持續(xù)結(jié)合亞群，造成IgG回收率損失(可低至90%)。此外，洗脫后的IgG易與染色質(zhì)滲漏物(如DNA)形成持久聚集體，因DNA在低pH下作為陽離子交換劑誘導IgG形成不可逆變性構(gòu)象。
圖3. 滴定至不同pH終點的蛋白A親和層析洗脫液的IgG濁度和宿主蛋白含量*
通過調(diào)節(jié)洗脫液至pH 5.5并結(jié)合微濾，可有效去除顆粒污染物，使HCP和DNA分別降低100倍和1000倍以上。需避免添加鹽或精氨酸，以防抵消效益并降低回收率。研究證實預處理去除染色質(zhì)可大幅提升蛋白A性能，同時強調(diào)洗脫后需恢復生理條件以使IgG重構(gòu)天然構(gòu)象。這些發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化層析工藝、提高產(chǎn)物純度和收率提供了關(guān)鍵依據(jù)。
4 生產(chǎn)工藝改進策略
預先去除染色質(zhì)可顯著提升蛋白A純化效果。研究證實，染色質(zhì)提取技術(shù)不僅能夠大幅降低宿主蛋白(HCP<10 ppm)和DNA(<1 ppb)殘留，使后續(xù)精純步驟簡化成為可能，還可有效增強病毒清除能力(非包膜病毒降低5 logs，包膜病毒降低9 logs)。
經(jīng)染色質(zhì)預處理后，蛋白A柱的NaOH清洗峰顯著減小，僅需50 mM NaOH即可達到優(yōu)于常規(guī)100 mM NaOH處理的清潔效果，有望延長層析介質(zhì)使用壽命。這一發(fā)現(xiàn)揭示了多種傳統(tǒng)澄清方法均通過間接作用于染色質(zhì)實現(xiàn)類似效果。目前，針對染色質(zhì)的系統(tǒng)性管理已成為下游工藝優(yōu)化核心，推動相關(guān)技術(shù)快速發(fā)展，為治療性抗體生產(chǎn)提供更高效、經(jīng)濟的純化解決方案。
小結(jié)
蛋白A親和層析純化流程中的雜質(zhì)作用詳解
(樣品為基于生理條件下澄清的細胞培養(yǎng)收獲液，此時未聚集的IgG與染色質(zhì)異質(zhì)聚集體無相互作用)
01 上樣
IgG接觸蛋白A后變性;同時超過80%的染色質(zhì)異質(zhì)聚集體流穿層析柱。其余20%結(jié)合于介質(zhì)顆粒外表面，阻塞IgG結(jié)合通道，使結(jié)合容量降低達20%。這些結(jié)合的異質(zhì)聚集體形成滲漏污染物庫，在洗脫階段引發(fā)多重問題。
02 洗滌
緩沖液可洗脫未結(jié)合污染物，但許多污染物仍通過結(jié)合在蛋白A上的染色質(zhì)異質(zhì)聚集體殘留?？刹捎脧娦Ь彌_液(含高濃度NaCl、精氨酸、尿素、有機溶劑、表面活性劑、低pH或高pH)進行組合洗滌，以解離異質(zhì)聚集體內(nèi)部結(jié)合，使部分組分被洗除，從而減少洗脫階段的污染物滲漏。
03 洗脫
低pH形成“完美風暴”——加劇蛋白A介導的IgG變性并使其從蛋白A解離;促進IgG與染色質(zhì)異質(zhì)聚集體形成穩(wěn)定非特異性結(jié)合;導致部分污染物從染色質(zhì)聚集體解離，但其他組分仍與蛋白A結(jié)合。與持續(xù)結(jié)合的染色質(zhì)結(jié)合的IgG會損失(通常約5%);與解離染色質(zhì)元件結(jié)合的IgG則形成聚集體。IgG組分中99%的宿主污染物源自染色質(zhì)異質(zhì)聚集體的解離。NaCl嚴重降低IgG回收率，精氨酸影響較輕，但兩者均加劇染色質(zhì)聚集體滲漏并抬高洗脫IgG的宿主污染水平。
04 預中和
調(diào)節(jié)至pH 5.5可使IgG從低pH下與染色質(zhì)元件的結(jié)合中解離，并促使這些染色質(zhì)元件重新結(jié)合成大型異質(zhì)聚集體顆粒，可通過微濾去除。過濾后宿主污染通常降低至少100倍。此操作僅在無鹽或無精氨酸時有效。
05 中和/再生
恢復生理條件使IgG重歸天然結(jié)構(gòu)。
06 清洗
50-100 mM NaOH可去除洗脫后仍結(jié)合在蛋白A上的大部分染色質(zhì)聚集體。在洗脫階段因與蛋白A結(jié)合的染色質(zhì)作用而損失的IgG于此步驟中被回收。
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聚合物基質(zhì)親和填料MabPurix P45，反壓低，載量高，不僅成功應用于多個單抗、Fc融合蛋白類樣品，且尤其適用于分子量及表觀尺寸較大的雙抗樣品下游純化。
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