引言
Introduction
環(huán)狀RNA（circRNA）由于其獨特的閉環(huán)結構、高穩(wěn)定性和對外切酶的抗性，在科研和臨床應用中展現(xiàn)出巨大潛力，成為研究基因表達調(diào)控、疾病診斷及新療法開發(fā)的重要工具。近日，中檢院在《Chemosensors》上發(fā)表的研究Study on the Characterization and Degradation Pattern of Circular RNA Vaccines Using an HPLC Method，通過SEC-HPLC方法詳細探討了circRNA疫苗的表征及降解模式，為circRNA的進一步應用提供參考依據(jù)（*查看底部留言區(qū)獲取文章鏈接）。文中參考USP法案推薦的mRNA聚體分析SRT SEC-1000體積排阻色譜柱，有效分離circRNA的聚集體、片段等相關雜質(zhì)，為circRNA降解研究提供關鍵信息。
背景介紹
CircRNA由線性mRNA進一步環(huán)化或IVT共環(huán)化得到，無論是mRNA或者circRNA其均具有較高的分子量，相比于常規(guī)抗體、蛋白，在未變性條件下的分析檢測，常需采用大孔徑的色譜柱產(chǎn)品。而市場上大孔色譜柱相對較少，賽分科技在大孔硅膠的研究上具有豐富的經(jīng)驗，滿足大孔分析的同時保證硅膠的機械穩(wěn)定性，適用于mRNA、DNA、病毒顆粒等大尺寸生物樣品的分析與質(zhì)量控制。
CircRNA反向剪接形成的獨特閉環(huán)結構雖賦予了其高度的穩(wěn)定性，但伴隨其合成過程產(chǎn)生的聚集體、片段、開環(huán)樣品，以及儲存或運輸過程的降解產(chǎn)物需進行質(zhì)量控制。為了探究circRNA的降解機制和產(chǎn)物，研究人員參考美國藥典(USP)Analytical Procedure for Quality of mRNA Vaccines and Therapeutics第二版推薦的線性mRNA檢測方法。而近期USP發(fā)布的第三版草案中，持續(xù)推薦賽分科技SRT SEC-1000用于mRNA聚體分析，研究人員也采用該色譜柱用于circRNA的純度評估與降解模式分析。
文章概述
對于circRNA產(chǎn)品，其研發(fā)工藝中容易被忽略的開環(huán)RNA、聚集體以及降解產(chǎn)物等雜質(zhì)的鑒定和分離一直是一大難題，對產(chǎn)品安全性和穩(wěn)定性造成影響。文章采用賽分科技SRT SEC-1000色譜柱，實現(xiàn)了circRNA樣品中各組分的有效分離，提供了關于circRNA疫苗穩(wěn)定性、聚集物形成以及降解產(chǎn)物積累的關鍵信息，為保證疫苗質(zhì)量和安全性提供支持。
聚集體片段分析
色譜柱：SRT SEC-1000(7.8×300 mm,5 μm,1000 Å)
流動相：無Rnase的磷酸鹽緩沖液(225 mM NaH2PO4+225 mM Na2HPO4,pH 7.0)
流速：0.3 mL/min
圖1.不同溫度下處理的circRNA樣品穩(wěn)定性
圖1是利用SRT SEC-1000色譜柱檢測circRNA樣品在4℃、25℃和37℃下的穩(wěn)定性結果。結果顯示，在4℃和25℃條件下，隨著存放時間的增加，circRNA樣品和聚集比例均發(fā)生下降，而RNA降解片段比例出現(xiàn)增加(9%~80%)。在37℃條件下，隨著存儲時長的增加，circRNA比例下降，mRNA降解片段比例出現(xiàn)增加，而聚集體比例會先增加后降低。因此可以推斷，在不同溫度存放過程中，circRNA樣品和聚集體的降解伴隨著mRNA降解片段的形成。
圖2. 在circRNA樣品中各組分的分析
圖2是對circRNA樣品中各組分進行進一步分析的結果。研究人員將SEC-HPLC與RP-HPLC結果相結合，實現(xiàn)了樣品中閉環(huán)、線性前體、nicked、聚體和降解產(chǎn)物的成功分離，驗證了其從完整狀態(tài)到切口狀態(tài)再到最終降解產(chǎn)物的降解模式。
實驗結論
綜上所述，研究人員使用賽分科技SRT SEC-1000體積排阻色譜柱，評估了circRNA樣品在不同溫度下的穩(wěn)定性及降解模式，較低溫度下circRNA樣品和聚集體比例均發(fā)生下降，較高溫度下在降解過程中出現(xiàn)聚集體比例先增加后降低，最終完全降解為片段的情況。該研究對于circRNA降解模式的研究為疫苗儲存、運輸?shù)陌踩院陀行杂兄匾饬x。
制備收集推薦
CircRNA由于其環(huán)狀結構，在分子量上通常與線性mRNA有所不同。因此在制備過程中，通過優(yōu)化SEC的分離參數(shù)和條件，可以實現(xiàn)對circRNA的高純度分離，提高circRNA的制備效率。特別是當circRNA與線性mRNA的分子量差異較大時，SEC的分離效果尤為顯著。
cricRNA純化制備
色譜柱：SRT SEC-2000(4.6×300 mm,5 μm,2000 Å)
流動相：無Rnase的TE緩沖液
圖3.柱純化富集環(huán)狀RNA樣品
圖4.凝膠電泳分析純化前后環(huán)狀RNA樣品
圖3是北京大學魏文勝課題組的案例（點此鏈接再次閱讀），研究人員采用賽分科技SRT SEC-2000色譜柱，對富含circRNA的餾分進行柱純化，將純化前后的樣品再次進行凝膠電泳分析（見圖4），得到高純度樣品，可用于后續(xù)藥效實驗等操作。
案例分享
賽分科技大孔徑色譜柱已廣泛應用于mRNA以及circRNA的分析。賽分科技國內(nèi)外客戶均有采用體積排阻色譜柱用于mRNA樣品分析及制備，并發(fā)表相關研究文獻，摘錄部分文件可再次瀏覽。
鏈接：點擊以下文章再次閱讀，通過SEC分析、制備mRNA樣品：
《文獻速遞 | SRT SEC分離純化環(huán)狀RNA》
《文獻速遞 | 光散射技術對rAAV及mRNA-LNP樣品生物物理表征》
《文獻速遞|高純度circRNA制備收集助力TCR-T藥物研發(fā)》
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